果蝇基因组工程


概述  

      CRISPR/Cas9TALENZFN是三种高效的基因组编辑工具,它们通过设计序列特异性的DNA结合元件,协同DNA核酸酶在基因组的目标序列处造成双链断裂 (double-strand break, DSB), 激发非同源末端连接 (Non-homologous end joining, NHEJ) 或同源重组 (homologous recombination, HR) 修复机制。在果蝇基因组工程的应用中,NEHJ途径能够在断裂末端处随机引入短序列插入或删除 (indel) 或突变;而通过提供含同源臂的供体DNA,同源重组修复机制 (HDR) 能够特异性地编辑目标序列。

    目前,CRISPR/Cas9系统在果蝇基因组编辑中应用最为广泛。


CRISPR/Cas9系统

      CRISPR/Cas (clustered regularly interspaced palindromic repeats/CRISPR associated, 成簇的规律间隔的短回文重复序列/CRISPR相关) 系统是一种存在于细菌、古细菌中的天然免疫系统。IICRISPR/Cas9系统利用crRNAs (~20nt) 识别外源DNA的互补序列,其后在trans-activating crRNA (tracrRNA) 的辅助下,Cas9内切酶结合识别位点形成Cas9复合体,激活酶活性,切断识别位点的序列形成双链断裂。  


   基因组


  CRISPR/Cas9系统在果蝇基因组编辑的应用中,通常将crRNAtracrRNA构成一个嵌合体RNA (chiRNA或gRNA)。系统要求gRNA的目标序列需要紧跟NGGNAG PAM序列 (protospacer adjacent motif),通过编辑gRNA~20 bp识别序列,引导Cas9内切酶在目标序列处形成双链断裂。

        因为CRISPR/Cas9系统是通过RNA-DNA特异性识别工作,Cas9内切酶可以同时切断多个gRNA目标位点,这样有利于通过同源重组修复机制对目标序列段进行精确的DNA敲除、敲入、或置换。


  

详细信息请查看以下网站:


基于D.melanogaster genome assembly 6,可在果蝇全基因组范围内选择或设计CRISPR目标位点,基于核酸序列 可用于估计gRNA目标序列的剪切效率。

考虑到您选择的果蝇种与已公布的基因组序列可能存在多态性, 采用您提供的DNA序列识别gRNA的目标位点,并可参考已公布的基因组序列对这些位点进行评估,参考序列包括D.melanogaster release 6, D. melanogaster vas-Cas9(III) (BDSC#) 全基因组序列和其它果蝇亚种的基因组序列。


参考文献

Gratz SJ, Cummings AM, Nguyen JN, Hamm DC, Donohue LK, Harrison MM, Wildonger J, and O'Connor-Giles KM (2013) Genetics 194: 1029-1035

Gratz SJ, Wildonger J, Harrison MM, and O'Connor-Giles KM (2013) Fly (Austin) 7

Bassett AR, Tibbit C, Ponting CP, Liu JL (2013) Cell Rep 4(1): 220
Kondo S, Ueda R (2013) . Genetics 195(3): 715

Port F, Chen HM, Lee T, Bullock SL (2014) PNAS 111(29): E2967

Port F, Muschalik N, Bullock SL (2015) G3 5(7): 1493

Ren XJ, Sun J, Housden BE, Hu YH, Roesel C, Lin SL, Liu LP, Yang ZH, Mao DC, Sun LZ, Wu QJ, Ji JY, Xi JZ, Mohr SE, Xu J, Perrimon N, Ni JQ (2013) . PNAS 110(47): 19012

Ren X, Yang Z, Xu J, Sun J, Mao D, Hu Y, Yang SJ, Qiao HH, Wang X, Hu Q, Deng P, Liu LP, Ji JY, Li JB, Ni JQ (2014) Cell Rep 9(3): 1151

Zhang X, Koolhaas WH, Schnorrer F. (2014) G3 4(12): 2409


CRISPR/Cas9系统果蝇品系

果蝇品系

种名 种库号 基因型 描述 备注
vas-Cas9(X) BDSC# y[1] M{vas-Cas9}ZH2A w[1118] Cas9的表达受控于vas调控序列,位于ZH-2A (2A3) 位点。Cas9构建质粒含3xP3-GFP标记,attP位点含3xP3-RFP标记 RFP+ GFP+
vas-Cas9(X) RFP- BDSC# y[1] M{vas-Cas9.RFP-}ZH-2A w[1118] 与51323/51324相同的Cas9构建质粒注射BDSC#24480NF - 去除M{vas-int.Dm}ZH-102D和loxP-3xP3-RFP的果蝇品系 GFP+ RFP-
vas-Cas9(II) BDSC# w[1118]; PBac{y[+mDint2]=vas-Cas9}VK00037/CyO, P{w[+mC]=Tb[1]}Cpr[CyO-A] Cas9的表达受控于vas调控序列,位于VK00037 (22A3) 位点。 Cas9构建质粒含3xP3-GFP标记。w+ 位于CyO平衡子上 y+ GFP+ w+ CyO
vas-Cas9(III) BDSC# w[1118]; PBac{y[+mDint2]=vas-Cas9}VK00027 Cas9的表达受控于vas调控序列,位于VK00027 (89E11) 位点。 Cas9构建质粒含3xP3-GFP标记。另有w[1118]; PBac{y[+mDint2]=vas-Cas9}VK00027/TM6B, Tb[1],即带平衡子的品系 y+ GFP+


果蝇品系

种名 种库号 基因型 描述 备注
nos-Cas9(X) NIG-FLY# y2 cho2 v1 P{nos-Cas9, y+, v+}1A/FM7c, KrGAL4 UAS-GFP Cas9的表达受控于nos调控序列,位于X染色体 y+ v+ (red eye)
nos-Cas9(II-attP40) NIG-FLY# y2 cho2 v1; attP40{nos-Cas9}/CyO Cas9的表达受控于nos调控序列,位于II染色体attP40 (25C6)位点 y+ v+ (v+ 较难观察到, red eye )
yw; nos-Cas9(II-attP40) - y1 w1118; attP40{nos-Cas9}/CyO yw背景(果蝇更健康),Cas9的表达受控于nos调控序列, 位于II染色体attP40 (25C6)位点。 y+ CyO (white eye)
nos-Cas9(II-2A) NIG-FLY# y2 cho2 v1; Sp/CyO, P{nos-Cas9, y+, v+}2A Cas9的表达受控于nos调控序列,位于II染色体CyO平衡子上 y+ v+ Sp CyO (v+ 较难观察到, red eye)
yw; nos-Cas9(III-attP2) - y1 w1118; attP2{nos-Cas9}/TM6C,Sb Tb yw背景(果蝇更健康),Cas9的表达受控于nos调控序列, 位于III染色体attP2 (68A4)位点。另有y1 w1118; attP2{nos-Cas9}, 即纯合的品系 y+ (white eye)
nos-Cas9(III-3A) NIG-FLY# y2 cho2 v1; P{nos-Cas9, y+, v+}3A/TM6C, Sb Tb Cas9的表达受控于nos调控序列,位于III染色体 y+ v+ TM6C Sb Tb (v+ 较难观察到, red eye)


果蝇品系

种名 种库号 基因型 描述 备注
Act5C-Cas9。P aka CFD1 BDSC# y[1] M{w[+mC]=Act5C-Cas9.P}ZH-2A w[*] Cas9的表达受控于Act5C调控序列,广泛表达。插入位点为ZH-2A(2A3) w+ RFP+
nos-Cas9.P aka CFD2 BDSC# y[1] M{w[+mC]=nos-Cas9.P}ZH-2A w[*] Cas9的表达受控于nanos调控序列。插入位点为ZH-2A(2A3) w+ RFP+
UAS-Cas9.P aka CFD4 BDSC# P{ry[+t7.2]=hsFLP}1, y[1] w[1118]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-Cas9.P}attP40 Cas9的表达受控于UAS。hsFLP的插入是猜测。插入位点为attP40(25C6) y+ w+
UAS-Cas9.P aka CFD3 BDSC# P{ry[+t7。2]=hsFLP}1, y[1] w[1118]; P{y[+t7。7] w[+mC]=UAS-Cas9。P}attP2/TM6B, Tb[1] Cas9的表达受控于UAS调控序列。hsFLP的插入是猜测。插入位点为attP2(68A4) y+ w+ TM6B Tb
nos-Gal4/UAS-Cas9.P aka CFD3-nos BDSC# P{ry[+t7.2]=hsFLP}1, y[1] w[1118]; P{y[+t7.7] w[+mC=UAS-Cas9.P}attP2 P{w[+mC]=GAL4::VP16-nos.UTR}CG6325[MVD1] Cas9的表达受控于UAS 调控序列。GAL4在卵子形成期表达。nos-GAL4和hsFLP的插入是猜测。插入位点为attP2(68A4), 86B4 y+ w+
act-Cas9(D10A) (nickase) aka CFD13 -> P{ry[+t7.2]=hsFLP}1, y[1] w[1118]; P{y[+t7.7] w[+mC]=act-Cas9D10A}attP2 Cas9的表达受控于Act5C调控序列。Cas9基因含有D10A突变,因此将Cas9核酸酶转变成切口酶。插入位点为attP2(68A4) y+ w+


Act5C-Cas9, Lig4果蝇品系

种名 种库号 基因型 描述 备注
Act5C-Cas9, Lig4 (X) BDSC# y[1] M{Act5C-Cas9.P.RFP-}ZH-2A w[1118] Lig4[169] M{Act5C-Cas9.P}ZH-2A果蝇品系,已经通过cre/loxP切除miniwhite和3xP3-RFP。Act5C-Cas9位于lig4169背景的X染色体上 RFP-



创建稳定的gRNA表达品系

为了创建稳定的attP-gRNA表达品系,您可以采用PhiC31列表中任意一个vermillion+背景、attP在常染色体上的品系。我们将注射后的G0代成虫与y-v-品系杂交筛选v+后代,交付您的v+ G2代转基因品系与从v-背景、 attP品系得到的相同。如果v+转基因品系需要在X染色体,请选用X染色体v-背景的attP果蝇,例如BDSC#34769。这只是常规的Plan H或Plan I服务,附加v+筛选。您可以请我们保留得到的gRNA品系,用它与所选择的Cas9果蝇品系杂交, F1代胚胎用于之后的Plan RG/RH/RI服务。


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