PhiC31整合酶介导的定点转基因系统

概述

        PhiC31整合酶介导的定点转基因系统是在果蝇中应用噬菌体PhiC31整合原理建立位点特定的转基因品系的系统。PhiC31整合酶识别特异序列attP(噬菌体结合位点)和attB(细菌结合位点),使两段序列之间发生高效且不可逆的整合反应。将含attB序列的质粒注射入含attP序列的果蝇品系,在PhiC31整合酶作用下得到稳定的转基因品系,目标基因位于attL和attR之间(不可逆反应)。

       如果attP品系没有PhiC31整合酶基因,我们采用 (RFP+, GFP+表现型)作为PhiC31整合酶的基因组来源;如果转基因品系的筛选标记与荧光筛表现型有关,我们可能采用(y+, 无荧光表现型)作为PhiC31整合酶基因组来源,如果是后者的情形,请告知我们。

       以vermilion+为筛选标记的情形,例如,为了创建稳定的attP-gRNA品系,您可以采用以下列表中任意一个v+背景、attP在常染色体上的品系。我们注射后的G0代成虫与y-v-杂交筛选v+后代,交付您的v+ G2代转基因品系与从v-背景、 attP品系得到的相同。如果v+ 转基因需要在X染色体,请选用X染色体v-背景的attP果蝇,例如BDSC#34769。这只是常规的Plan HPlan I服务,附加vermilion+筛选。您可以请我们保留得到的gRNA品系,用它与所选择的Cas9果蝇品系杂交, F1代胚胎用于之后的Plan RG/RH/RI服务。


P{CaryP}系统
     
Calos实验室通过P-element转基因方法创建了含P{CaryP}attP序列 (有yellow基因) 的两个果蝇品系。

       Perrimon实验室继续构建了一系列含P{CaryP}attP序列的果蝇品系,并以luciferase为报告基因比较了不同组织中不同位点的位置效应 (Position Effect)。

        Bellen实验室创建了一个在Y染色体上含P{CaryP}attP序列的果蝇品系。

      详细信息请查看参考文献


PhiC31-RMCE系统

       2006年6月, Wu实验室发表了一种方法,他们创建了含P{attP.w+.attP}盒式结构的果蝇品系,这样含{attB。目的片段.attB}盒式结构的质粒显微注射入胚胎后,在PhiC31整合酶作用下,通过盒式交换反应得到位点处为{attL。目的片段.attL}的转基因品系。之后Bateman实验室创建了平衡子上P{attP.w+.attP}盒式结构的果蝇品系

       此外,仅含一个attB序列的质粒,也可以插入PhiC31-RMCE位点的任何一个或两个attP序列处。

       详细信息请查看参考文献。


P[acman]系统

        Bellen实验室开发的P[acman]系统,创建了一系列attP位点果蝇品系(位点yellow基因),并首先应用了含双复制子的attB-BAC质粒 (oriS确保BAC稳定地低拷贝复制和同源重组用;而oriV在条件诱导下复制,用以制备质粒) 和“Gap-repair”同源重组技术。

        Bellen实验室在P[acman]质粒基础上构建了平均大小为21 kb83 kb两个BAC质粒库,保存于CHORI BACPAC资源库中。

        详细信息请查看参考文献、Bellen实验室网站CHORI BACPAC Resources 网站
      

        

        

        另注:attB-BAC质粒可以应用于整个PhiC31系统。


FlyC31系统
      
Basler实验室创建了一系列含M{3xP3-RFPattP}位点的果蝇品系,并且构建了M{vas-int.Dm}ZH-2A果蝇品系,其PhiC31整合酶基因进行了果蝇密码子优化,它可以作为整个PhiC31系统的基因组PhiC31整合酶基因来源。BDSC保存的FlyC31系统果蝇品系除了attP位点以外,已经带有M{vas-int。Dm}ZH-2A。

        FlyC31系统的attP果蝇品系及所用载体含有loxP序列,可以在转基因完成后通过Cre/loxP重组反应,切除非必要序列 (3xP3-RFPw+、载体DNA序列等),只保留loxP-目标片段-attL序列。

        为了含Fluorescence标记的质粒可以选用FlyC31系统的attP位点,我们通过Cre/loxP反应切除了原始位点上的3xP3-RFP序列,创建了对应位点的NF (没有RFP) 的果蝇品系及其M{vas-int。Dm}NFZH-2A果蝇品系,对于含有loxP序列的质粒仍然可以在转基因完成后通过Cre/loxP反应切除非必要序列,只保留loxP-目标片段-attL序列。

         详细信息请查看参考文献和FlyC31网站和我们网页上的列表。

      

MiMIC系统
     
MiMIC系统由BellenHoskinsSpradling实验室联合开发,是基于Minos转座反应构建的位点遍布基因组且功能多样的系统,MIMIC果蝇的两端含有attP的盒式结构,显微注射两端含有attB的盒式结构的质粒,在PhiC31整合酶作用下通过盒式交换反应将目的片段插入选定位点。此外,对于仅含一个attB序列的质粒,也可以插入选定位点的任何一个或两个attP序列处。

         详细信息请查看参考文献和Bellen实验室网站MiMIC 页面:
      
 

关于PhiC31系统和Gateway载体系统的特别说明

      PhiC31系统attB位点和Gateway载体系统相结合的“Gateway-PhiC31载体例子为

        请注意Gateway载体(例如Murphy 实验室的) attP1attP2attB1attB2PhiC31系统attPattB概念不同。


参考文献:

Groth A, Fish M, Nusse R, Calos MP (2004)  Genetics 166: 1775

Markstein M, Pitsouli C, Villalta C, Celniker SE, Perrimon N (2008) Nature Genetics 40: 476

Szabad J, Bellen HJ, Venken KJT (2012)  G3 (Bethesda) 2(9): 1095

Bateman JR, Lee AM, Wu C-t (2006)  Genetics 173: 769

Sun FF, Johnson JE, Zeidler MP, Bateman JR (2012)  G3 2: 551

Venken KJT, He Y, Hoskins RA, Bellen HJ (2006)  Science 314: 1747

Bischof J, Maeda RK, Hediger M, Karch F, Basler K (2007)  Proc Natl Acad Sci USA 104: 3312

Venken KJT, Schulze KL, Haelterman NA, Pan H, He Y, Evans-Holm M, Carlson JW, Levis RW, Spradling AC, Hoskins RA, Bellen HJ (2011) Nat Methods 8(9): 737


PhiC31系统果蝇品系

P{CaryP}果蝇品系

位点名称 BDSC# 基因型 Cytosite# 转基因品系眼睛颜色1 转化效率评分[平均值(BACs)]2
attP18 y1 w67c23 P{CaryP}attP18 6C12 橙色 3.4 (0.0)
attP4 -
y1 w67c23 P{CaryP}attP4 12C6 橙色 2.1 (0.0)
attP3 y1 w* P{CaryP}attP3 19C4 淡橙色 0.7 (0.7)
attP40 - y1 w67c23; P{CaryP}attP40 25C6 红色 7.2 (4.2)
attP30 -
y1 w67c23; P{CaryP}attP30 29C3 红色 2.5 (nd)
attP14 -
y1 w67c23; P{CaryP}attP14 36A10 橙色 1.7 (1.0)
attP33 -
y1 w67c23; P{CaryP}attP33 50B6 橙色 4.8 (1.3)
attP16 -
y1 w67c23; P{CaryP}attP16 53C4 红色 4.5 (1.6)
attP1 y1 w67c23; P{CaryP}attP1 55C4 红色 4。5 (2。2)
attP23 -
y1 w67c23; P{CaryP}attP23 60C7 红色 - (nd)
attP88 -
y1 w67c23; P{CaryP}attP88 64A12 红色 - (nd)
attP2 y1 w67c23; P{CaryP}attP2 68A4 红色 5。4 (2。0)
attP112 -
y1 w67c23; P{CaryP}attP112 68C13 红色 4.0 (nd)
attP10 -
y1 w67c23; P{CaryP}attP10 85D8 橙色 0。7 (nd)
attP64 -
y1 w67c23; P{CaryP}attP64 89B9 红色 4.7 (nd)
attP52 -
y1 w67c23; P{CaryP}attP52 89B11 ?
- (nd)
attP154 -
y1 w67c23; P{CaryP}attP154 97D2 橙色 5.0 (1.8)
attPY 41124 y1 w*/Dp(2;Y)G; P{CaryP}attPY Y 红色 5。9 (nd)
# FlyBase Drosophila melanogaster (R6.10)

1 眼睛颜色是显微注射、筛选得到的转基因品系在杂合状态下羽化三天后观察的结果

2 转化效率评分是基于我们过往实际订单的统计结果, 分别显示了所有订单的平均值和>30 kb BAC质粒的评分值

PhiC31-RMCE果蝇品系

位点名称
参考 BDSC#
基因型
Cytosite#
果蝇品系
眼睛颜色
3

转化效率

2

JB37B
P{attP.w+.attP}JB37B
37B7
红色
6.8
JB38F
P{attP.w+.attP}JB38F
38F1
橙色
5.8
JB53F
P{attP.w+.attP}JB53F
53F8
橙色
2.6
JB89B
P{attP.w[+].attP}tara[JB89B]
89B8
红色
6.3
38451
w1118; Dr1/TM3, P{attP.w+.attP}FS10 Sb1 Ser1
79A2
橙色
2.0
38452
w1118; Dr1/TM3, Sb1 Ser1 P{attP.w+.attP}FS18
100D1
橙色
2.0
38453
y1 w*; snaSco/CyO, P{attP.w+.attP}J04
37B8
橙色
8.0
38454
y1 w*; snaSco/CyO, P{attP.w+.attP}J08
37F2
红色
4.6
38455
FM7h, P{attP.w+.attP}FS2/C(1)DX, y1 f1
10B6
红色
2.3
38456
FM7h, P{attP.w+.attP}FS5/C(1)DX, y1 f1
6F3
橙色
3。0

# FlyBase Drosophila melanogaster (R6。10)

2 转化效率评分是基于我们过往实际订单的统计结果, 显示了所有订单的平均值

3 由于果蝇品系本身含有P{attP.w+.attP},眼睛颜色是纯合子羽化三天后观察的结果

P[acman]果蝇品系

位点名称
BDSC#
基因型
Cytosite#
转基因品系
眼睛颜色
1
转化效率评分[平均值 (BACs)]2
VK10
4
PBac{yellow[+]-attP-3B}VK00010
chromosome 2
-
- (nd)
VK15
PBac{yellow[+]-attP-9A}VK00015
chromosome 2
3.7 (2.4)
VK38
PBac{yellow[+]-attP-3B}VK00038
5B8
2.9 (1.1)
VK06
PBac{yellow[+]-attP-9A}VK00006
19E7
淡橙色
1.8 (1.3)
VK37
PBac{yellow[+]-attP-3B}VK00037
22A3
橙色
4.7 (2.3)
VK12
PBac{yellow[+]-attP-9A}VK00012
25A3
淡橙色
1.0 (nd)
VK02
PBac{yellow[+]-attP-3B}VK00002
28E7
5.9 (3.1)
VK03
PBac{yellow[+]-attP-3B}VK00003ab
31B1, 40A4
红色,橙色
5.0 (3.0)
VK03a
9724a
PBac{yellow[+]-attP-3B}VK00003a
31B1
红色?
- (nd)
VK03b
9724b
PBac{yellow[+]-attP-3B}VK00003b
40A4
橙色?
8.2 (4.1)
VK11
PBac{yellow[+]-attP-3B}VK00011
40E4
0。3 (0。0)
VK14
PBac{yellow[+]-attP-9A}VK00014
43A1
橙色
6。1 (3。0)
VK16
PBac{yellow[+]-attP-3B}VK00016
47C6
橙色
2.8 (0.0)
VK08
PBac{yellow[+]-attP-3B}VK00008
50A3
淡橙色
5.5 (nd)
VK30
9747
PBac{yellow[+]-attP-9A}VK00030
50E1
橙色
3.3 (1.4)
VK18
PBac{yellow[+]-attP-9A}VK00018
53B2
橙(斑驳)
6.0 (2.7)
VK22
PBac{yellow[+]-attP-9A}VK00022
57F5
橙色
5.0 (3.2)
VK01
PBac{yellow[+]-attP-3B}VK00001
59D3
橙色
4。3 (4。3)
VK31
PBac{yellow[+]-attP-3B}VK00031
62E1
橙色
5.9 (2.7)
VK33
PBac{yellow[+]-attP-3B}VK00033
65B2
5。1 (3。8)
VK39
PBac{yellow[+]-attP-3B}VK00039
67E4
-
4。8 (nd)
VK19
PBac{yellow[+]-attP-9A}VK00019
68D2
4.2 (1.9)
VK23
PBac{yellow[+]-attP-9A}VK00023
70A2
4.4 (3.8)
VK36
PBac{yellow[+]-attP-3B}VK00036
70C4
- (nd)
VK05
PBac{yellow[+]-attP-9A}VK00005
75A10
橙色
6。2 (2。4)
VK13
PBac{yellow[+]-attP-9A}VK00013
76A2
5。3 (4。4)
VK21
PBac{yellow[+]-attP-9A}VK00021
76C5
橙色
- (nd)
VK29
97464
PBac{yellow[+]-attP-9A}VK00029
80
-
- (nd)
VK07
PBac{yellow[+]-attP-3B}VK00007
82A1
橙色
2.1 (0.0)
VK32
PBac{yellow[+]-attP-3B}VK00032
85A2
淡橙色
2.0 (0.0)
VK40
PBac{yellow[+]-attP-3B}VK00040
87B10
7.8 (1.2)
VK27
PBac{yellow[+]-attP-9A}VK00027
89E11
7。1 (1。8)
VK28
PBac{yellow[+]-attP-9A}VK00028
92F1
橙色
6。8 (2。0)
VK26
PBac{yellow[+]-attP-9A}VK00026
96F3
淡橙色
3.1 (3.8)
VK20
PBac{yellow[+]-attP-9A}VK00020
99F8
淡橙色
5.3 (4.1)
VK24
4
PBac{yellow[+]-attP-9A}VK00024
101F1
0。0 (nd)

# FlyBase Drosophila melanogaster (R6.10)

1 眼睛颜色是显微注射、筛选得到的转基因品系在杂合状态下羽化三天后观察的结果

2 转化效率评分是基于我们过往实际订单的统计结果, 分别显示了所有订单的平均值和>30 kb BAC质粒的评分值

4 这些种很难得到转基因品系

FlyC31果蝇品系

位点名称
参考 BDSC#
基因型
CytoSite#
转基因品系
眼睛颜色
1
转化效率评分 [平均值 (BACs)]2
ZH-2A
M{3xP3-RFP.attP'}ZH-2A
2A3
橙色
2.8 (0.6)
ZH-22A
M{3xP3-RFP.attP'}ZH-22A
22A2
淡橙色
5.1 (3.4)
ZH-51C
M{3xP3-RFP。attP'}ZH-51C
51C1
淡橙色
7.2 (5.1)
ZH-51D
5
M{3xP3-RFP.attP}ZH-51D
51D9
6。0 (2。4)
ZH-58A
M{3xP3-RFP.attP}ZH-58A
58A3
淡橙色
7.2 (5.5)
ZH-68E
M{3xP3-RFP.attP'}ZH-68E
68E1
淡橙色
6.8 (3.5)
ZH-86Fa
M{3xP3-RFP.attP'}ZH-86Fa
86E18
7。0 (3。8)
ZH-86Fb
M{3xP3-RFP。attP}ZH-86Fb
86F8
7。1 (4。0)
ZH-96E
6,7
M{3xP3-RFP。attP'}ZH-96E (with M{vas-int。Dm}ZH-2A)
96E10
淡橙色
2。5 (nd)
ZH-102D
M{3xP3-RFP。attP}ZH-102D (with M{vas-int。Dm}ZH-2A)
102F4
7.1 (4.0)
24480NF
-
24480NF8 ZH-2A
2A3
橙色
2.0 (nd)
24481NF
-
24481NF8 ZH-22A
22A2
淡橙色
- (0。0)
24482NF
-
24482NF8 ZH-51C
51C1
橙色
0.5 (nd)
24483NF
-
24483NF8 ZH-51D
51D9
5.4 (nd)
24484NF
-
24484NF8 ZH-58A
58A3
淡橙色
1.7 (nd)
24485NF
-
24485NF8 ZH-68E
68E1
淡橙色
1.1 (0.0)
24486NF
-
24486NF8 ZH-86Fa
86E18
3。0 (nd)
24749NF
-
24749NF8 ZH-86Fb
86F8
7。7 (nd)

# FlyBase Drosophila melanogaster (R6.10)

1 眼睛颜色是显微注射、筛选得到的转基因品系在杂合状态下羽化三天后观察的结果

2 转化效率评分是基于转化效率评分是基于我们过往实际订单的统计结果, 分别显示了所有订单的平均值和>30 kb BAC质粒的评分值

5 位点受临近hibris基因Enhancer trap影响,不适用于报告基因的分析研究或异位表达 (ectopic expression)造成影响的情况。

6 果蝇品系弱,并且注射后存活率低

7 Service WPCR确认转基因位点)不适用

8 去除loxP-3xP3-RFP,即位点为M{loxP. attP}或M{loxP. attP’}的果蝇品系

其它果蝇品系

位点名称
BDSC#
基因型
CytoSite#
转基因品系
眼睛颜色
1
转化效率评分[平均值(BACs)]2
su(Hw)attP8
y1 w* P{CaryIP}su(Hw)attP8
8E10
3。2 (0。0)
su(Hw)attP6
9
y1 w* P{CaryIP}su(Hw)attP6
24A2
3.0 (nd)
su(Hw)attP5
y1 w* P{CaryIP}su(Hw)attP5
50F1
5.8 (nd)
su(Hw)attP4
y1 w* P{CaryIP}su(Hw)attP4
67E2
2。0 (nd)
su(Hw)attP1
7
y1 w* P{CaryIP}su(Hw)attP1
87B13
5.6 (nd)
su(Hw)attP2
9
y1 w* P{CaryIP}su(Hw)attP2
92D9
3。5 (nd)
-
10
y1 P{CaryIP}su(Hw)attP8 v1
8E10
-
6.0 (nd)
VIE260B
P{attP,y+,w3'}VIE-260B
2L
8.7 (nd)
JK22C aka JMK-96
-
w1118; P{CaryP}JK22C
22C3
4.6 (0.0)
JK73A aka JMK-97
-
w1118; P{CaryP}JK73A
65C3
4。7 (0。0)
JK65C aka JMK-98
-
w1118; P{CaryP}JK65C
66B4
4.9 (0.0)
JK66B aka JMK-99
-
w1118; P{CaryP}JK66B
73A9
5.4 (1.2)

# FlyBase Drosophila melanogaster (R6。10)

1眼睛颜色是显微注射、筛选得到的转基因品系在杂合状态下羽化三天后观察的结果

2 转化效率评分是基于我们过往工作中的实际订单计算产生的, 分别显示了所有订单的平均值和>30 kb BAC质粒的评分值

7 Service WPCR确认转基因位点)不适用

9 非特异性整合率较高,建议选用Service WPCR确认转基因位点)

10 这个种适于筛选标记为vermilion+attP位点在X染色体的转基因服务

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